کلونینگ و بیان آنزیم اندوگلوکاناز نوترکیب قارچی در مخمر و بهبود خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم با استفاده از روش های مهندسی پروتئین

هر روز میزان استفاده از سوخت های فسیلی و بهای آن افزایش و منابع آن کاهش می یابد. به همین علت استفاده از منابع تجدیدپذیر انرژی و تولید سوخت های زیستی(بیواتانول) مورد توجه قرار گرفته است. یکی از مناسب ترین مواد اولیه برای تولید سوخت های زیستی ترکیبات سلولزی می باشد. از مهمترین میکروارگانیسم های تولید کننده ی آنزیم سلولاز قارچ trichoderma reesei می باشد. کمپلکس سلولازی شامل 3 آنزیم اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و بتا-گلوکوزیداز می باشد. آنزیم اندوگلوکانازii از کلیدی ترین آنزیم های این کمپلکس و آغازگر حمله به زنجیره سلولزی است. در این تحقیق جهت بیان مناسب آنزیم نوترکیب، ژن جدیدegii بر اساس ترجیح کدونی مخمر پیکیاپاستوریس و هانسنولا پلی مورفا سنتز شد. تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم اندوگلوکاناز نوترکیب نشان دهنده بهینه فعالی در دمای ?c75 و 8/4=ph بود. با بهینه سازی شرایط بیان آنزیم از جمله دمای بیان، ph بیان، غلظت متانول و ترکیبات محیط کشت میزان بیان آنزیم به u/ml 2359 افزایش یافت. در ادامه جهت بهبود خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم از جمله فعالیت آنزیمی و مقاومت حرارتی آنزیم از روش مهندسی پروتئین و جهش زایی هدفمند استفاده گردید. در مقایسه ساختار آنزیم اندوگلوکاناز t. reesei با آنزیم مقاوم به حرارت thermoascus aurantiacus مشخص گردید که 2 باند دی سولفیدی مهم در آنزیم مقاوم به حرارت حذف شده است؛ بنابراین با ایجاد 2 جهش جداگانه c169v و c393h دو باند دی سولفیدی از ساختار پروتئینی آنزیم اندوگلوکاناز t. reeseiحذف گردید. بررسی خصوصیات بیوشیمیایی نشان داد که میزان ثابت ویژگی در دو آنزیم جهش یافته egii-c169v و egii-c393h نسبت به آنزیم فاقد جهش به ترتیب 9/1 و 6/1 برابر افزایش یافته است و همچنین میزان پایداری حرارتی هر دو آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم فاقد جهش بیش از 2 برابر افزایش نشان می دهد. به نظر می رسد با توجه به فعالیت آنزیمی و مقاومت حرارتی بالا ، اندوگلوکانازهای مهندسی شده پتانسیل مناسبی جهت استفاده در صنعت بیواتانول را دارا باشند.